國立陽明交通大學牙醫學系
國際臨床數位牙醫教學與示範中心
口腔癌精準醫療
主要有CD44和S100A7，其中CD44 是一種細胞表面醣蛋白，參與許多細胞調節途徑，包括細胞增殖和遷移。它也是一種腫瘤起始和幹細胞相關的生物標誌物，目前已被證明會導致不同腫瘤的腫瘤起始，包括在口腔癌中的過度表現[38, 39]。而在正常上皮細胞中，CD44 表現主要發生在基底和基底上區域。當發育異常現象持續惡化時，CD44 表現移動到表層，顯示出其在癌前病變時期的角色。 此外，與原發腫瘤相比，CD44 在復發腫瘤的表面較豐富。CD44 被金屬蛋白酶切割並以可溶形式 (solCD44) 從細胞表面釋放，金屬蛋白酶在晚期口腔癌中過度表現，綜合上述可得之可以透過檢測唾液樣本中是否存在 CD44，以評估口腔癌的風險高低。 另外，S100A7是一種鈣結合蛋白，是多基因鈣調節蛋白的成員S100系列，它在正常上皮的上層分化良好的棘層中表達。在與癌症發展相關的高風險發育不良口腔病變中發現了過度表現的S100A7。而就有目前可以透過StraticyteTM（Proteocyte AI，TO，加拿大）測試，並結合 StraticyteTM 專有算法、高級成像和數字病理學，定量測量有口腔癌風險的患者活檢組織中的S100A7生物標誌物。與組織病理學發育異常分級相比，StraticyteTM提供了更高的客觀性、靈敏度和預測能力，並且透過定量評估 S100A7，StraticyteTM 的臨床表現能夠比單獨進行組織病理學發育不良分級更好地判定發生OSCC的風險。
蛋白質標誌物
在mRNA的生物標誌物中，以OAZ1、SAT及DUSP1為主要代表。OAZ1又稱為鳥氨酸脫羧酶抗酶，由多胺依賴性機制誘導，且已被發現在DNA修復中很重要，並與人類 OSCC細胞的轉移能力有關。SAT是多胺代謝分解代謝途徑中的限速乙酰轉移酶(rate-limiting acetyltransferase)，該酶催化亞精胺(spermidine)和精胺(spermine)的乙醯化，並參與調節細胞內多胺的濃度及運出細胞等工作。 SAT的表達已被證明在前列腺癌和口腔癌中明顯增高。DUSP1是I型半胱氨酸蛋白酪氨酸磷酸酶的亞型，參與多種訊息路徑。且有研究指出，與正常對照組相比，OSCC患者唾液中的DUSP1 mRNA 顯著增加。在一項PRoBE (prospective-specimen-collection, retrospective-blinded evaluation)的臨床試驗研究中納入了170位口腔癌患者的可疑病灶，以進行開發新的預測型mRNA模型，以便於預測患者疑似口腔癌的病灶是否有可能發展為口腔癌。且該研究還驗證了可用於OSCC的六個先前確定的唾液mRNA標記（IL1、IL8、OAZ1、SAT1、S100P 和 DUSP1）和五個housekeeping mRNAs（MT- ATP6、RPL30、RPL37A、RPL0 和 RPS17）。個別mRNA的RT-qPCR Ct值顯示，在OSCC患者中濃度增加了大約兩倍到近四倍。而重新再將此預先指定的六個與OSCC有關之個別 mRNA 標誌和預先指定的多標誌模型，利用新的一群受試者進行驗證，再次證實這些標誌和多標誌的驗證方法具有一定的穩定度。
mRNA生物標誌物(mRNA Biomarker)
臨床開發中口腔癌診斷方式
近幾年，臨床上檢測口腔癌的方式出現利用檢體中的生物標誌物(Biomarker)來檢驗是否在未來有演變成口腔癌的風險。由於生物標誌物包含各種類型的分子，如核酸、蛋白質、肽、酶促變化、抗體、代謝物、脂質和碳水化合物。而生物標誌物可取自人類檢體，例如血液、血清、血漿、脫落細胞、身體分泌物（例如：痰、唾液）或排泄物（例如：糞便、尿液）。
目前依照臨床實驗評估下，有效的生物標誌物具有幾個優點，包括客觀、定量評估、測量精準度和可靠性。此外，癌症疾病的生物標誌物可用於估計疾病風險、篩檢原發性癌症以及區分良性或不同類型的惡性腫瘤。此外，生物標誌物可以預測患者的預後情形並監測疾病狀態及發展情形，同時，也能進一步對治療後疾病復發的機率或對治療的反應進行評估[20] 。以下將針對DNA甲基化生物標誌物、mRNA生物標誌物以及蛋白質標誌物進行闡述：
活細胞染色是一種常見的組織染色方法，使用的是嗜酸性染料甲苯胺藍(toluidine blue)，來對酸性細胞成分如DNA或RNA進行染色。染色後則可藉由發育異常的組織會比起發育正常的組織有更多的 DNA 和RNA來進行染色上的濃淡、細胞染色型態進行區分。利用甲苯胺藍的染色方式已被證明具有高靈敏度，[4, 5]。事實上，利用甲苯胺藍染色能顯示出明顯的病灶邊界分界，更能夠協助臨床醫師在選擇活檢部位的判別，及幫助判別高危患者病變處的鑑定。在一篇關於評估甲苯胺藍染色的功效對於醫院的診斷準確性之研究中發現，利用甲苯胺藍染色作為臨床檢查的輔助工具，有助於早期發現口腔和口咽部惡性病變，研究中提及針對 55 名患有 OPMD 或惡性病變的受試者進行了詳細的臨床檢查和甲苯胺藍染色，而透過將染色結果與組織病理學檢查進行比較，甲苯胺藍檢測惡性腫瘤的靈敏度為 92.6%，特異性為 67.9%，總體診斷準確率為80%。結果表明，甲苯胺藍染色法可作為口腔癌和口咽癌的一種有價值的輔助診斷方法[4]。惟，甲苯胺藍之特異性較低的原因在於細胞良性增生，或是正處於發炎反應中的細胞也可能在染色的過程中保留了明顯的顏色及不正常的細胞型態而導致假陽性的結果出現，故甲苯胺藍染色的特異性仍較低。 另一種染色方式為Lugol’s iodine，此方式在臨床上的優勢在於快速、簡單且又便宜，主要為診斷黏膜是否病變，可用於有高風險會發展成惡性腫瘤的患者或病灶疑似惡化的患者[6]。由於碘會被存在於細胞質中的正常多醣鏈的螺旋(coil)所吸收，因此會呈現出棕色。而這種反應並不會出現在發育不良或有變異的黏膜中，只有正常的組織才會被染成棕色，故發育不良或有異常的黏膜就不會染上棕色，而此方式也已被證實對於癌前病變與惡性病變的染色是有效的。
目前DNA甲基化生物標誌物中以ZNF582和PAX1有較多相關研究，ZNF582屬於編碼於克魯珀相關框結構域鋅指蛋白(Krüppel-associated box zinc finger proteins (KRAB-ZFPs))的大型轉錄調節因子家族中的其中一種。最近的一篇研究顯示， ZNF582在鼻咽癌(NPC)中作為抑癌基因(suppressor gene)的角色，來調節黏附分子Nectin-3和NRXN3的轉錄和表達，ZNF582的超甲基化會透過調節這些黏附分子來促進NPC的癌細胞轉移。在肛門癌和食管癌中也觀察到 ZNF582具有腫瘤抑制作用，其甲基化似乎具有作為癌症檢測生物標誌物的潛力。PAX1最主要的就是以其paired-box domain在胚胎發育過程中扮演著重要的角色，同時也是腫瘤抑制基因。高程度的PAX1甲基化會誘導腫瘤發生，包括口腔癌和子宮頸癌[27-29]。ZNF582和PAX1最初選自SCC型癌症的多基因組，包括 ZNF582、PAX1、SOX1、NKX6.1和 PTPRR 基因；這些後來發展成為一種使用口腔脫落細胞檢測口腔發育不良和口腔癌的方法。在一項研究中提及，從65名正常口腔黏膜受試者、107名口腔癌前病變患者和95名OSCC患者中收集了口腔上皮細胞。ZNF582甲基化能夠檢測早期輕微發育不良或口腔病變，靈敏度和特異性分別為 85%和87%。同樣，PAX1甲基化能夠識別中度發育不良或口腔病變，靈敏度和特異性分別為72%和86%。此外，兩個基因的高程度甲基化和陽性與疾病嚴重程度的顯著增加有關。因此，這些標記物可用作視診結果異常的患者的協助工具。另一項研究針對95名OSCC患者中的80名進行研究，發現ZNF582 和 PAX1 的甲基化在癌症部位明顯高於鄰近的正常部位。與ZNF582甲基化陰性、PAX1甲基化陰性和ZNF582/PAX1甲基化陰性患者相比，ZNF582甲基化陽性結果、PAX甲基化陽性結果和ZNF582/PAX1甲基化陽性結果的OSCC患者的3年存活率明顯縮短。這些發現表明，癌旁正常組織以及癌症部位的ZNF582和PAX1甲基化是潛在的生物標誌物，可以幫助預測 OSCC進展和OSCC患者的存活率。從研究中發現，ZNF582和PAX1的高甲基化與原發性和復發性OSCC患者的OSCC嚴重程度相關，在原發性和復發性 OSCC患者中可檢測到組織中的兩種類型的DNA甲基化，並且不受年齡、性別或飲酒量的影響。 兩種 DNA 甲基化生物標誌物均以 EpiGene ZNF582 DNA 檢測試劑盒和 EpiGene PAX1 DNA 檢測試劑盒(iStat Biomedical，台灣新北市)的名稱作為體外診斷試劑(IVD)進行開發，並且皆為CE 批准的體外診斷(IVD)。該診斷測試透過測量 ZNF582 和 PAX1 的甲基化程度來檢測口腔癌前病變和口腔癌的風險程度。它是一項輔助工具，可幫助僅利用視診的醫師進行判斷，並有助於確定是否進行組織病理學檢查的後續決定。醫師從可疑病變處收集口腔脫落細胞，然後對細胞樣本進行基因組DNA提取和DNA亞硫酸氫鹽轉化，在此過程中，未甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。在 DNA 亞硫酸氫鹽轉化完成後，接著進行甲基化特異性 PCR 以檢測兩個基因的甲基化程度(甲基化胞嘧啶)。